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Uso da Epiderme Humana Reconstruída (RHE) em estudos de dermatofitoses

Estudo demonstra que a epiderme humana reconstruída é eficaz para investigação de mecanismos de infecção e testes de agentes antifúngicos



O modelo de Epiderme Humana Reconstruída (RHE) é uma ferramenta alternativa que permite aplicações em variadas áreas de pesquisa. O modelo de RHE é projetado para mimetizar a epiderme humana, constituindo uma plataforma com alta correlação in vitro/in vivo e que possibilita a realização de testes de irritação e permeação cutânea, por exemplo.


No entanto, sua usabilidade não se limita apenas a estas aplicações. Em um estudo científico, pesquisadores utilizaram o modelo de RHE para investigar os mecanismos de infecção por agentes fúngicos causadores de dermatofitoses, demonstrando a versatilidade deste modelo [1].


O estudo das dermatofitoses


As dermatofitoses são infecções superficiais de estruturas queratinizadas causadas por diferentes espécies de fungos, denominados dermatófitos. Em geral, são limitadas ao estrato córneo da pele em humanos, exceto em casos de pacientes imunossuprimidos, onde podem atingir camadas mais profundas.


Estima-se que 20% da população mundial sofram com esse tipo de doença, sendo a espécie de dermatófitos Trichophyton rubrum a responsável por mais de 90% das lesões humanas. Apesar da alta prevalência, ainda existem poucos estudos sobre esse tipo de infecção e as opções terapêuticas são limitadas a depender do caso clínico e gravidade [3].


Diferentes modelos experimentais in vitro já foram estabelecidos para o estudo de dermatofitoses, como amostras de unhas ou cabelos, cultura de células epidérmicas em monocamadas ou modelos ex vivo de infecções em pele humana. No entanto, todos eles apresentam sérias limitações, seja funcional ou na obtenção de amostras.


Por outro lado, o modelo de RHE pode ser produzido em laboratório a partir do cultivo de queratinócitos humanos, apresentando alta semelhança morfológica e funcional com a epiderme humana. Além disso, estudos demonstraram que a RHE é adequada para a caracterização das respostas de queratinócitos a compostos químicos e irritantes ou sensibilizadores, em camadas no estrato córneo [2].


A RHE como ferramenta para avaliação de mecanismos de infecção e testes de agentes antifúngicos


Neste estudo, cientistas avaliaram a potencial aplicação do modelo de RHE como ferramenta para investigação de infecções in vitro, principalmente pelo dermátofito Trichophyton rubrum [1].


Foram avaliados neste trabalho os mecanismos envolvidos na infecção fúngica, incluindo a adesão de artroconídios, invasão e proliferação de dermatófitos e as respostas induzidas na epiderme hospedeira (RHE). Além disso, foi possível avaliar a eficácia de medicamentos antifúngicos (como o miconazol) utilizando este modelo.


Para isso, foram cultivadas em laboratório cepas diferentes de T. rubrum e de outros dermatófitos. Após o 11º dia do processo de reconstrução da epiderme, a RHE foi infectada com as cepas de dermatófitos. Esse tempo foi definido pelo surgimento de características morfológicas e funcionais da RHE semelhantes à epiderme humana. Após, o pesquisadores monitoraram os elementos fúngicos por meio de técnicas de histoquímica ou pela detecção de genes fúngicos dentro dos lisados de RHE pela técnica de PCR em tempo real (qPCR).


A RHE é capaz de mimetizar uma infecção fúngica in vivo


O modelo de RHE mostrou-se eficaz para o estudo da infecção por dermatófitos, revelando proliferação progressiva de artroconídeos após quatro dias da inoculação. A invasão limitou-se inicialmente ao estrato córneo, sem atingir camadas profundas, o que mimetiza uma infecção in vivo.


A partir do 5º dia, os elementos fúngicos começaram a atingir camadas mais profundas, levando a danos teciduais graves. É importante destacar que estes resultados foram encontrados também com as diferentes cepas de T. rubrum testadas além de outros dermatófitos, tornando este um modelo aplicável a diferentes agentes patogênicos.


Análises gênicas (qPCR) revelaram que o número de cópias dos genes fúngicos aumentou progressivamente durante os quatro dias após a inoculação. A aderência dos artroconídios também aumentou de acordo com o tempo de contato com a RHE, chegando a 91% após 24 horas.


A RHE pode ser utilizada para estudos de eficácia com agentes antifúngicos


Por fim, os pesquisadores testaram se o modelo de RHE é eficiente como ferramenta para avaliação da eficiência de novos potenciais compostos antidermatófitos.


Para isso, o grupo de pesquisa testou a eficácia do medicamento miconazol na proliferação fúngica. Inicialmente foi definida a concentração mínima eficaz do medicamento (3,2 μg/ml) em testes laboratoriais. Dois cenários foram testados: miconazol aplicado topicamente na RHE simultaneamente com os artroconídios; miconazol adicionado topicamente na RHE um dia após ser inoculado com artroconídios.


Em ambos, o miconazol foi capaz de inibir o crescimento fúngico, resultados estes encontrados em análises histológicas e confirmados pelo teste de qPCR. Adicionalmente, o grupo de pesquisa avaliou a eficácia do medicamento em RHE previamente infectada (após quatro dias). Novamente, o miconazol foi capaz de parar o processo de infecção.


Estes são resultados promissores que transformam a RHE em uma potencial ferramenta para utilização em diversos estudos científicos e ensaios farmacológicos.


No entanto, é necessário pontuar que as infecções encontradas após o quinto dia da inoculação no modelo proposto tendem a ser mais graves do que o encontrado in vivo. Isso porque o modelo de RHE carece de células imunes, por exemplo, para frear o processo infeccioso. Além disso, em uma situação in vivo, o número de elementos fúngicos dispersos no estrato córneo é menor.


Estas são limitações que devem ser consideradas ao definir o desenho experimental e ao analisar os resultados obtidos.


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Referências:


[1] Faway, É., Cambier, L., Mignon, B., Poumay, Y., & Lambert de Rouvroit, C. (2017). Modeling dermatophytosis in reconstructed human epidermis: A new tool to study infection mechanisms and to test antifungal agents. Medical mycology, 55(5), 485-494. doi: 10.1093/mmy/myw111

[2] Frankart A, Malaisse J, De Vuyst E, Minner F, de Rouvroit CL, Poumay Y. (2012). Epidermal morphogenesis during progressive in vitro 3D reconstruction at the air-liquid interface. Exp Dermatol. 21(11):871-5. doi: 10.1111/exd.12020.


[3] Havlickova, B., Czaika, V. A., & Friedrich, M. (2008). Epidemiological trends in skin mycoses worldwide. Mycoses, 51, 2-15. doi: 10.1111/j.1439-0507.2008.01606.x

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